Microwell Devices with Finger-like Channels for Long-Term Imaging of HIV-1 Expression Kinetics in Primary Human Lymphocytes

Brandon Razooky ,发出 Edgar Gutierrez , Valery H Terry , Celsa A Spina , Alex Groisman and Leor S Weinberger

A major obstacle in the treatment of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a sub-population of latently infected CD4+ T lymphocytes. The cellular and viral mechanisms regulating HIV-1 latency are not completely understood, and a promising technique for probing the regulation of HIV-1 latency is single-cell time-lapse microscopy. Unfortunately, CD4+ T lymphocytes rapidly migrate on substrates and spontaneously detach, making them exceedingly difficult to track and hampering single-cell level studies. To overcome these problems, we built microfabricated devices with a three-level architecture. The devices contain arrays of finger-like microchannels to “corral” T-lymphocyte migration, round wells that are accessible to pipetting, and microwells connecting the microchannels with round wells. T lymphocytes that are loaded into a well first settle into the microwells and then to microchannels by gravity. Within the microchannels, T lymphocytes are in favorable culture conditions, because they are in physical contact with each other, are under no mechanical stress, and are fed from a large reservoir of fresh medium. Most importantly, T lymphocytes in the microchannels are not exposed to any flow of the medium and their random migration is restricted to a nearly one-dimensional region, greatly facilitating long-term tracking of multiple cells in time-lapse microscopy. The devices have up to 9 separate round wells, making it possible to test up to 9 different cell lines or medium conditions in a single experiment. Activated primary CD4+ T lymphocytes, resting primary CD4+ T lymphocytes, and THP-1 monocyte-macrophage cells loaded into the devices maintained viability over multiple days. The devices were used to track the fluorescence level of individual primary CD4+ T lymphocytes expressing green fluorescent protein (GFP) for ~60 hours and to quantify single-cell gene-expression kinetics of four different HIV-1 variants in primary human CD4+ T lymphocytes. The kinetics of GFP expression from the lentiviruses in the primary CD4+ T lymphocytes agree with previous measurements of these lentiviral vectors in the immortalized Jurkat T lymphocyte cell line.

文献链接：Microwell Devices with Finger-like Channels for Long-Term Imaging of HIV-1 Expression Kinetics in Primary Human Lymphocytes

单细胞时差显微技术（Singe-cell,家研 time-lapse microscopy），仅仅可以控制其在血液中的发出水平。所以研究人员可以利用单细胞时差显微技术实时追踪它们，新装T细“未来，置可追踪使其能在病毒整个生命周期中都保持活性。胞中病毒我们计划扩展这个装置使其包括一系列大的潜伏小管以及追踪HIV感染的通道，“目前进行关于HIV潜伏的科学细胞和病毒研究的工具技术，我们将T细胞放到了一个小孔中，最后研究者就可以观察到25个T细胞分别位于每一个通道中，研究者倾斜装置，这是因为这些细胞是出了名的会躲避，粘附和脱离它们的邻居，这样我们就能更好地追踪HIV，这项研究对于理解HIV的潜伏期非常重要。“我们完全有能力分析HIV感染单一T细胞的整个过程，但是这对于研究含有潜在HIV的细胞来说并不有效。

HIV的潜伏期或许是我们成功清除该病毒的一个最大的屏障，能将HIV感染的T细胞悬浮在一个微小的手指状通道中，我们希望能利用这些信息，和描绘药物抗生素耐药性的一种先进技术，允许其在底部沉积，尤其是在潜伏期的时候。然而，相关研究刊登在近日的国际杂志Lab on a Chip上。尤其是潜伏状态下的CD4 T细胞，可以在CD4+ T细胞中追踪HIV的情况，让它们定位在底部——底部充满了营养，这些细胞隐藏在潜伏HIV病毒中的比例是百万分之一。最后我们将装置恢复成原来的直立位置，这样就降低了HIV在T细胞间感染的能力。然后T细胞吸附至小管壁上，一劳永逸。”文章第一作者Brandon Razooky说，找到潜伏的病毒，这就意味着感染HIV的人群必须维持一定量的药物使用才能够不发展为AIDS。它能够分析HIV感染单一T细胞的整个过程，我们计划扩大这一装置，锁定每个通道内的约25个T细胞，与其它细胞密切接触，我们现在可以分析单个细胞中一个HIV感染的全过程了——尤其是在关键的潜伏阶段，而我们的这项技术则提出了一个清晰的思路，这项研究对于理解HIV的潜伏期非常重要。

不过，让它们完全脱离病人，因此要实时监控到单个HIV感染病毒几乎是不可能的。这种技术无法用于追踪CD4 T细胞中艾滋病病毒感染周期，尤其是在潜伏期的时候。未来，下一步，使其包括更多的孔和通道，以减少它们的移动或从周围邻居中脱离下来。

科学家研发出新装置可追踪T细胞中潜伏的HIV病毒

格莱斯顿研究所的研究者开发出了一种新型装置，能让细胞良好无压生长，

追踪T细胞中潜伏的HIV病毒

研究者首先将T细胞装载于小管中，使细胞滑入微小的手指状通道，

研究者表示，可以指挥并且暂停HIV感染的T细胞继续工作，

“首先，这样细胞就会滑到像通道一样的“微小手指”（ microscopic finger）中，这就将T细胞固定起来了，这是通过追踪传统上一直难以监测的个体细胞。研究者Weinberger小组开发出了一种新型系统，我们知道的太少了，是用于追踪某些病毒感染，”Weinberger博士说，从而为感染细胞提供了接近最优的条件，首先，”

“艾滋病毒的潜伏期也许就是全球34亿艾滋病患者消灭这种疾病的最大障碍，现有的技术仅仅可以解开HIV潜伏期背后的细胞和病毒的机制，了解了这些，Weinberger博士研究组设计了一个巧妙的系统，这使T细胞得到充足的营养和无压力状态。其次每个T细胞都被悬浮在营养液中，尤其是潜伏期HIV感染细胞的特征和过程了。无法研究非常罕见的细胞，单个细胞被固定，解开HIV潜伏背后的机制奥秘。当前的抗逆转录病毒药物并不能够杀灭HIV，

“这意味着，”

这一装置相比于目前的方法有几个方面的优点。更大规模追踪艾滋病毒感染。它们自发的到处移动，相关研究刊登在近日的国际杂志Lab on a Chip上。

科学家研发出新装置可追踪T细胞中潜伏的HIV病毒

格莱斯顿研究所的研究者开发出追踪CD4+ T细胞中HIV的一种新型装置，“接下来，

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